流式的基本原理

A：何为流式细胞术？

流式细胞术（Flow Cytometry，简称FCM）是一种以流式细胞仪为检测手段，对单个微粒（通常是细胞）进行的一种快速、准确、客观、同时检测多参数，并可以对特定群体加以分选（需要流式仪具有分选功能）的技术。

研究的对象一般为生物颗粒：各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等。

检测的参数：主要分为三个参数

相对细胞大小（FSC）

相对细胞颗粒密度和内部复杂程度（SSC）

相对荧光强度

B、流式细胞仪的基本构成是怎样的？

流式细胞仪主要分为三大系统：

液流系统（聚焦细胞以供检测）

可以看出，上样速度会影响到样本流和鞘液流的压力差，它们的压力差越小，样本的上样速度越快。若是上样速度过快，会影响到单个细胞通过流动室，增加通道的CV值。对一些CV要求较高的实验，必须使用低速上样，以保证满足单个细胞通过流动室，得到较好的CV值。例如：一些倍数分析实验（细胞周期）等。

光学系统（激发和收集光信号）

激发光源：激光器和透镜，使激光束能集中于液流

可以看出，激光在液流处是平行排布的，所以不同激光分析同一个细胞的时候是存在时间延迟的。特别是分选的时候需要注意，调整好延迟以保证不同激光分析的是同一个细胞（后续分析板块会讲述到如何调整延迟），以保证分选的纯度。

信号接收：

FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，他们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要的光学元件为：滤光片（Filter）。滤光片主要分为长通（只有大于该滤光片的波长可以透过）、短通（只有小于该滤光片的波长可以透过）和带通滤光片（只有满足滤光片范围的波长可以透过）。注意：带通滤光片的500/50是500+/-25可以通过，也就是475~525nm的光可以透过。

BD仪器的收集系统为八棱镜全反射系统：（不同厂家的收集系统不太一样，不同型号的仪器也可能不一样，BD的八棱镜全反射系统为特有的专利收集系统）

从上图可以看出。一束完整的发射波长经过光纤导入到收集系统后，先由A通道的长通（LP）滤光片LP 750收集大于750nm的光（小于750nm的光全部经过全反射到达B通道），大于750nm的光由带通滤光片BP 780/60经过选择性接收750~810nm的发射光，也就是我们常用的PE-Cy7荧光。其余的通道反复如此……（BD仪器为不同激光有独立的分析系统，488激光和640激光等都分别有独立的分析系统。其他厂家仪器可能不一样）

电子系统（将光信号转化为电信号，并使其具体数字化以供计算机分析）

光电检测器：光电二极管和光电倍增管（photomultiplier,PMT），将光信号转换成电子信号

前置放大电路：将信号等比例放大，输出电脉冲信号

数据处理系统：计算机系统数据采集与处理。将得到的信号处理为可视图等。

根据自己需要，选择不同的图形以满足实验需求即可。

小结：

C、检测参数：

散射光信号：物理信号，不依赖荧光染料。用于区分不同细胞群体的基本形态上的差异。

散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此成为细胞的物理参数。

前向散射叫（Forward Scatter，FSC）:与细胞的大小及面积有关，在FCM应用钟，常取FSC做阈值，来排除样品中的各种碎片。

侧向散射角（Side Scatter，SSC）：与激光束正交90℃的散射光信号，与细胞粒度及细胞器复杂程度正相关。

上图三：可以看出通过散射信号，可以区分裂解红细胞后的粒细胞群、单核细胞群、淋巴细胞群。

荧光信号：需要标记相应的荧光染料。检测现有抗原的表达量。